研发验证试验结果分享： 《日粮有机酸通过恢复肉鸡肠道菌群来减轻高密度饲养应激诱导的肠道炎症》

近几十年来，全球鸡肉产量一直在增长，2021年达到9910万吨。为了满足市场供应并实现高效率，肉鸡生产中普遍采用高放养密度(HSD)饲养，以最大限度地提高笼的使用面积。然而，HSD应激会对集约化养殖动物的生长性能、肠道屏障功能和肠道菌群产生不利影响。有机酸(OA)因其改善家禽生长性能和肠道健康的能力而被广泛用作饲料添加剂。然而，日粮中添加OA是否能改善HSD应激引起的肉鸡肠道屏障损伤，目前尚不清楚。据推测，日粮中添加OA可能会改变肉鸡肠道菌群组成和相互作用，从而改善HSD应激诱导的肠道炎症。本研究旨在确定日粮中OA对HSD应激的肉鸡生长性能、应激参数、肠道发育、炎症反应以及肠道菌群组成和相互作用的影响，并分析了肠道SCFA谱与肠道炎症的关系，以进一步探索微生物在调节炎症反应中的作用。本研究有助于更好地理解肠道菌群和宿主在HSD应激的肠道炎症中的相互作用，有助于优化营养策略以缓解HSD诱导的动物应激。

1.试验设计

试验选用528只1日龄雄性AA肉鸡，随机分为3个处理，每个处理12个重复，其中正常饲养密度10只， HSD组17只，试验期42日龄。其中OA，商品名为加强肥酸宝（Selko®，由泰高集团提供），是游离（缓释）短链脂肪酸与中链脂肪酸的混合物，添加剂量为2 公斤/吨 (0-21天)和1 公斤/吨 (22-42天)。颗粒料，自由采食和饮水。

2.试验结果

2.1生长性能

与NC和OA组相比，在0 ~ 21天PC组平均日采食量明显降低(P< 0.05)，而在第1-21天，各组之间的体重、ADG和F/G没有差异（P<0.05）。在第22-42天，PC组的BW和ADG降低，并伴有比NC组更高的F/G。同时，与PC组相比，观察到OA组BW、ADG增高， F/G降低。

2.2 应激和糖脂代谢参数

为了研究HSD应激是否会引起肉鸡的应激反应，评估了应激、炎症指标（包括皮质酮、LPS和AST）以及GLU、TG、TC、HDL-C和LDL-C的糖脂代谢。PC组的皮质酮、LPS和AST水平高于NC组（P<0.05），这表明HSD诱导了宿主应激。PC组LDL水平显著升高，GLU、TG水平及HDL-C / LDL- c比值降低(P < 0.05)，提示HSD引起糖脂代谢紊乱。在GLU、LDL-C、HDL-C / LDL-C比值方面，NC组与OA组比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。

2.3 肠道发育与杯状细胞分析

进一步评估日粮添加加强肥酸宝对HSD暴露肉鸡肠道发育的影响，我们比较了的肠道相对重量、形态和杯状细胞计数。与NC组相比，在第42天，HSD暴露使的十二指肠、空肠和全肠相对重量显著降低（P<0.05）。试验第42天，与NC组相比，PC组肉鸡空肠绒毛高度(VH)显著降低(P < 0.05)（图1D所示）。图1所示数据对结果进行了统计证实。肠黏膜可见大量紫红色杯状细胞(黑色箭头)(图1E)。3组间杯状细胞计数无显著变化(P > 0.05)。

图1肉鸡肠道形态结构。A, B空肠形态结构; C杯状细胞计数; D空肠形态结构，40倍放大观察; E 200倍放大观察空肠杯状细胞(黑色箭头所示紫色细胞)分布; NC，正常饲养密度饲喂基础饲粮; PC，高放养密度饲喂基础饲粮; OA，高放养密度饲喂在基础饲粮中添加加强肥酸宝（有机酸）。肩标a−b值，表示有统计学意义(P < 0.05)，下同。

2.4 炎症反应和TLR4/NF- κB信号通路

为了评估HSD应激是否通过诱导炎症反应然后破坏肠道屏障而导致肠道形态不良，我们检测了炎症细胞因子和肠道屏障标志物(图2)。与NC组相比，PC组IL-1β和TNF-α水平显著升高，表明HSD诱导了肉鸡肠道炎症反应(P < 0.05，图2A, D)。OA组IL-10水平显著高于NC和PC组，提示OA具有抗炎作用(P < 0.05，图2C)。在紧密连接蛋白基因表达方面，与NC组相比，PC组ZO-1 mRNA水平明显下调(P < 0.05，图2E)。同样，在NC组和OA组之间，ZO-1 mRNA水平无显著差异(P > 0.05，图2E)。

RT-PCR和免疫组织化学染色分析TLR4/NF-κB信号通路相关基因和蛋白。如图2E所示，与NC组相比，PC组NF-κB、MyD88 mRNA水平明显上调，TLR4 mRNA水平也有上调的趋势(P < 0.05或0.05≤ P < 0.10)。上述结果提示，HSD应激通过激活TLR4/NF-κB信号通路引起肉鸡肠道炎症。值得注意的是，与PC组相比，OA组TLR4、NF-κB和MyD88 mRNA水平显著下调(P < 0.05)，说明OA通过抑制TLR4/NF-κB信号通路改善了肠道炎症。免疫组织化学染色分析进一步验证了这些结果。细胞核内可见阳性棕色颗粒，表明TLR4/NF-κB被激活表达(图2G)。免疫组化定量分析证实，与NC组相比，HSD应激显著上调P - nf -кB的表达(P < 0.05，图2F)。同样，与PC组相比，OA组P-nf-кB表达明显下调(P < 0.05，图2F)。

图2高饲养密度暴露对肉鸡肠道屏障功能和炎症反应的影响。A空肠黏膜白细胞介素1β (IL-1β)水平; B空肠黏膜白细胞介素-2 (IL-2)水平; C空肠黏膜白细胞介素-10 (IL-10)水平; D空肠黏膜肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平; E紧密连接及TLR4/NF-κB信号通路相关基因mRNA表达水平; F定量分析p-NF的免疫组织化学表达-кB; G免疫组化检测空肠组织p-NF-кB的表达(200x，棕色颗粒为阳性反应); NC，正常饲养密度饲喂基础饲粮; PC，高放养密度饲喂基础饲粮; OA，高放养密度，在基础饲粮中添加加强肥酸宝（有机酸）。

2.5 肠道菌群多样性

在微生物组分析中，我们过滤后平均获得52,398个高质量序列。PC组Shannon指数（用于评估微生物群α-多样性）显著高于其他组(P < 0.05，图3A)。采用β-多样性分析评价3组间微生物图谱的相似性。从图3C可以看出，所有样本主要分散在2个簇中，PC组的样本位置不同，与NC组和OA组明显分开。ANOSIM分析还表明，PC组的肠道菌群组成与NC组不同，而OA恢复了HSD暴露肉鸡的肠道菌群，并使其更接近NC组(R = 0.140, P = 0.005)。维恩图显示了asv的差异，与NC组相比，PC组和OA组分别有100个和107个独特的asv(图3B)。此外，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是主要门种，Bacteroides、Faecalibacterium、Lactobacillus、Ruminococcus_torques_group、Coprobacter、Alistipes、UCG-005和Christensenellaceae_R-7_群是所有组的优势属(图3D, E)。

进一步分析肠道菌群组成的变化。HSD应激显著降低了拟杆菌门菌的丰度(P < 0.05)，这伴随着厚壁菌门丰度呈增加趋势(P = 0.078)。在属水平上，各组间共鉴定出24种差异菌，其中PC组中Christensenellaceae_R-7_群、Lachnoclostridium、Negativibacillus、Erysipelatoclostridium、Eubacterium_hallii_群、GCA-900066575、Ruminococcus_gauvreauii_群、Defluviitaleaceae_UCG-011及Merdibacter丰度显著增加 ( P < 0.05)。与NC和OA组相比，PC组Bacteroides、Ruminococcus_torques_group和Anaerotruncus的丰度呈下降趋势(0.05 ≤  < 0.10)。此外，通过LEfSe分析，确定了细菌作为生物标志物来区分所有组的微生物群。如图3F所示，PC组微生物富集有Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG-010、Shuttleworthia、Lachnospira、GCA-900066575、Eubacterium_ventriosum_group、CHKCI001，均属于毛螺旋科。此外，我们发现，在PC组中，Defluviitaleaceae (defluviitaleace_ UCG-011)、丹毒杆菌科(Erysipelatoclostridium)、Ruminococcaceae (Negativibacillus)的相对丰度增加，而在OA组中，Eggerthellaceae (Gordonibacter和Slackia)和Ruminococcaceae (DTU089)的相对丰度增加。

图3肉鸡肠道微生物多样性分析。A Shannon指数在asv水平上;B 基于asv水平的维恩图; C基于bray-curtis的主坐标分析(PCoA)；D门水平微生物组成; E属水平微生物组成; F肠道菌群线性判别分析效应大小(LDA > 3, P < 0.05); NC，正常饲养密度饲喂基础饲粮; PC，高放养密度饲喂基础饲粮; OA，高放养密度在基础饲粮中添加有机酸。

2.6. 肠道微生物群与表型之间的相关性

为了探索与生长性能和肠道炎症相关的微生物群，分析了细菌丰度与表型之间的相关性(图4)。厚壁菌门丰度与生长性能呈显著负相关，与血清LPS呈显著正相关；拟杆菌门丰度与生长性能呈显著正相关，与血清LPS呈显著负相关。此外，Defluviitaleaceae、Oscillospiraceae、Rikenellaceae和Christensenellaceae的丰度分别与血清AST、LDL、CLU水平和MyD88的表达呈正相关。而丹毒杆菌科和毛缕菌科的丰度与肠黏膜IL-10水平呈显著负相关。同样，在属水平上也发现了微生物群与生长性能、血清参数、炎症因子和肠道屏障标志物的显著相关性。

图4肠道菌群丰度与表型的Spearman相关分析。A肠道菌群与生长性能及血清生化指标的相关性分析。B肠道菌群与肠道炎症指标的相关性分析。蓝色表示正相关，红色表示负相关。相关性分别为0.01 < P≤0.05*、0.001 < P≤0.01**、P≤0.001**

2.7 肠道SCFAs谱图及回归分析

微生物群落共存的差异表明其中的细菌具有不同的功能。因此，我们检测并量化了肠道微生物群的主要碳水化合物发酵产物，以评估微生物活性(图5D)。与NC组相比，PC组显著降低了乙酸和丁酸含量(P < 0.05)。而乙酸和丁酸含量在NC组和OA组间差异不显著(P > 0.05)。

图5 肉鸡盲肠短链脂肪酸的浓度

为了进一步证实微生物群在肠道炎症反应中的作用，我们对显著不同的SCFAs浓度与应激和炎症因子水平之间进行了回归分析(图6)。乙酸浓度与皮质酮、LPS和TNF-α水平之间存在显著的线性负相关，同时与IL-10水平呈线性正相关。同时，除IL-2外，丁酸浓度与炎性细胞因子水平呈显著的线性相关。

图6短链脂肪酸与肠道炎症参数的回归分析。A-F乙酸浓度及其与皮质酮、脂多糖(LPS)、白细胞介素-1β (IL-1β)、白细胞介素-2 (IL-2)、白细胞介素-10 (IL-10)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的关系; G-L丁酸浓度及其与皮质酮、LPS、IL-1β、IL-2、IL-10和TNF-α的关系。

3.结论

综上所述，饲粮中添加OA可通过恢复HSD诱导的肠道菌群组成和相互作用，增加SCFAs的产生，抑制TLR4/NF-κB信号通路，改善肉鸡肠道炎症和生长性能。这些发现证明了肠道微生物群在介导HSD诱导的炎症反应中的关键作用，有助于探索缓解动物HSD诱导的应激的营养策略。

获得更详细信息，请参考英文原：Journal of Animal Science and Biotechnology (2022) 13:124